筛选两万个人类基因，耶鲁团队发现介导蛋白，采用“洗衣液”原理规避耐药性，直接杀灭侵入性细菌

为什么感冒时吃了很多药病情却不见好转？其中一个主要原因是，人们长期服用抗生素类感冒药，使人体内的许多病原体产生耐药性。在免疫学中，如何高效杀灭革兰氏阴性菌，如沙门氏菌等耐药性强的细菌，是一个令人头疼的问题。

最近，耶鲁大学医学院的研究团队发现了一种名为“APOL3(载脂蛋白L3)”的介导蛋白，它可以像商场里卖的“洗手液”一样简单粗暴地杀死入侵人体的病原微生物，而不会对人体本身造成伤害。

该团队将研究重点放在人体自身的自主免疫系统上，发现该系统中的“干扰素刺激蛋白”能够以简单高效的方式清除致病微生物。

相关论文发表在国际期刊《科学》上，题目是“活性人介导蛋白L与类似去污剂可杀死细胞内病原体”。相关论文

这项研究由耶鲁大学霍华德休斯医学院博士后Ryan Gold、耶鲁大学系统生物学研究所博士后朱世伟和耶鲁大学医学院微生物致病机理和免疫生物学副教授John McMeekin领导。朱世伟

负电子显微镜显示APOL3直接破坏了细菌的内膜。

研究结果揭示，APOL3可通过其两亲性螺旋和跨膜结构域直接与细菌内膜中的磷脂结合，形成具有动态性质的纳米磷脂环，像“洗手液”去污一样溶解细菌内膜中的磷脂，破坏细菌内膜的完整性，导致细菌死亡。

所以APOL3蛋白只要接触到致病菌的内膜，就能以简单粗暴的方式杀死入侵人体的细菌。

病原菌的耐药性是科学难题之一。这项研究一针见血，强调人类自身可以进化出简单高效的自卫策略APOL3天然“清洁剂”。体外联合抗生素提高体内APOL3的表达水平，对于治疗耐药病原菌感染具有潜在的应用价值。筛选了2万个人类基因，进一步明确了APOL3的抗菌机制。

人体细胞中储存着丰富的营养物质，所以自然界中很多病原微生物、细菌、寄生虫都选择在细胞中增殖。

过去一般认为，机体主要依靠免疫细胞来消除细菌感染。但近年来发现，占机体绝大多数的非免疫细胞也能通过细胞自身免疫延缓和消除入侵细胞的病原体。

ⅱ型干扰素(IFN-γ)通过上调大量干扰素刺激基因的表达，在调节细胞自身免疫中发挥重要作用，但许多基因功能和抗菌机制尚未揭示。为了找到非免疫细胞中抵抗细胞内细菌感染的关键基因，团队使用CRISPR/Cas9系统筛选了2万个人类基因。pr-cas9技术筛选APOL3示意图

pr-cas9技术筛选APOL3示意图

APOL3可以杀死细胞内的病毒。

APOL3像“去污剂”一样简单粗暴地杀死细菌，更有效地结合和溶解细菌内膜中的酸性磷脂成分。这一研究结论增强了人们对非经典免疫系统的认知。

然而，IFN-γ在非免疫细胞和组织中的耐药性仍然难以捉摸。

首先，非免疫细胞往往被认为与免疫系统无关，因此被忽略。其次，在上皮细胞中，IFN-γ信号介导并刺激大量相关基因产物的表达，许多基因表达产物的功能和抗菌机制尚未揭示。因此，IFN-γ在非免疫细胞和组织中介导的免疫防御机制仍然难以捉摸。负电子显微镜显示形成了APPOL3和纳米磷脂环。

首先，用装载有慢病毒和全基因组sgRNA(单向导RNAs)文库的Cas9转导HeLa细胞。

其次，用干扰素激活这些细胞中ISGs的表达，用荧光标记的沙门氏菌感染HeLa细胞。

最后通过流式细胞仪分选出沙门氏菌高增殖的HeLa细胞群，通过高通量测序鉴定出该细胞群中特异性富集的sgRNA。

该团队利用全基因组CRISPR/Cas9进行体外筛选脂质体实验，揭示了一种新的非免疫细胞自我防御机制。

朱世伟说，“首先，我们发现APOL3可以显著抑制沙门氏菌等细胞内病原体的增殖。其次，我们利用高分辨率荧光显微镜、负染电镜、冷冻电镜和质谱进一步阐明了APOL3的抗菌机制。”

团队选择“沙门氏菌”作为研究载体，是因为它对这项研究工作的推进有实质性的帮助。

一、沙门氏菌是常见的食源性致病微生物，可引起食物中毒。中毒情况严重时，可导致误食者死亡。阐明沙门氏菌与宿主细胞之间的相互作用将有助于我们预防和治疗由沙门氏菌引起的疾病。

其次，沙门氏菌是研究细胞内感染机制的重要模式生物。科学界对沙门氏菌的生理特性有了比较完整的认识，也发展了突变株、基因表达株等多种研究细菌的工具。

结果表明，几种抗APOL3基因的sgRNA在其中高度富集，提示敲除APOL3会导致沙门氏菌在HeLa CCL2细胞中增殖。体内的“洗手液”APOL3，可以用简单粗暴的方式杀死入侵的细菌。

朱世伟说，“我们研究的一大亮点是再次提出人体表皮和上皮中的各类细胞都具有防疫和免疫的功能。我们发现，如果ⅱ型干扰素被外来细菌入侵，其表达会增加，人体的一些相关基因会自动被调动起来。”

该团队通过活细胞显微成像技术追踪APOL3，发现APOL3可以快速转移到暴露的细菌中，这是APOL3的其他蛋白质不具备的特性。超分辨率荧光成像显示，当APOL3靶向IFG-g激活细胞内病原体时，会对细菌内膜造成致命伤害。

例如，当治疗由致病菌感染引起的病人时，

因为很多致病菌对抗生素有耐药性，抗生素很难完全杀死它们。在这种情况下，首先调节患者的免疫系统是一种有效的方法。当患者自身免疫能力提高后，这些耐药病原体就能被有效杀死。

但是，APOL3作为一种强大的杀菌武器，是受到严格监管的。在静息状态下，APOL3的表达非常低。当细菌入侵时，人体会分泌干扰素IFNI-γ作为预警信号，诱导细胞大量表达APOL3等相应蛋白。APOL3需要配合GBP1(鸟苷酸结合蛋白1)蛋白发挥最大功效，从而突破细菌外膜的脂多糖，帮助APOL3接触细菌内膜，直接杀死入侵人体的细菌。进一步探索人体免疫系统的奥秘，让患者远离抗生素。

朱时伟做了一个生动的比喻。“APOL3和病原体有点像中国文化中的‘道法变’，整个免疫系统就像一个宇宙。有许多未解之谜有待探索。除了洗手液A，可能还有洗手液B或者c，这个研究只是个开始，还有很多宝藏有待发掘。”

就人类细胞而言，还有其他IFN-γ信号介导的效应蛋白需要了解。其他效应蛋白也具有类似于APOL3的抗菌功能。“我需要分别在细胞和分子水平上分析APOL3相关蛋白的结构，以进一步揭示抗菌机制。”朱世伟说。

由于病原菌的进化速度远快于抗生素的发明和新抗生素的寻找，当患者被耐药病原体感染时，通过增强干扰素介导的效应蛋白的表达来对抗耐药病原体，挽救患者的生命，可能是另一种可行的方案。

接下来，该团队将研究哪些干扰素刺激的基因蛋白实际上参与了直接绝育；比如团队目前关注的鸟苷酸结合蛋白如何识别病原微生物的外膜并将其破坏；能否利用体外重建模拟各种干扰素介导的效应蛋白协同工作，消灭病原微生物；能否利用冷冻电镜在细胞和分子水平上揭示这些效应蛋白的杀菌机制。这将是团队未来两到三年要攻克的主要难题。打破前进路上的枷锁，勇攀科研高峰。

据悉，朱世伟博士在细菌学领域专注于鞭毛马达的组装和结构的研究。为了原位获得鞭毛马达的三维结构信息，朱世伟漂洋过海来到耶鲁大学，研究冷冻电子显微镜、冷冻电子断层扫描和图像后处理技术。后来，他发表了一系列细菌鞭毛马达的原位三维结构(PNAS，114(41)，10966-10971)。

“结合我的细菌学背景以及对冷冻电镜和图像后处理技术的掌握，我选择了细菌学和免疫学相互交叉的基于细胞的自身免疫作为主要研究方向。利用冷冻电子断层扫描和冷冻电子显微镜单颗粒技术，分别在细胞和原子水平上揭示了细胞自身免疫过程中IFN-γ信号介导的相关效应蛋白的抗菌机制。”朱世伟说。

最近，该团队首次发现植物可以通过相分离来增强自身的免疫防御。朱世伟利用冷冻电子层析首次原位捕捉到相分离的结构，并在此基础上提出了相分离介导的植物自卫模型(Nature 594(7863)，424-429)。真核生物可以采取各种策略来抵抗病原菌的入侵。这一系列研究成果拓宽了朱世伟对自主免疫防御的认知。

朱时伟说:“科研的挑战是不可避免的。我们应该有勇气打破前进道路上的枷锁，永远攀登科学高峰，为这一研究领域的蓬勃发展贡献力量。”(摘自美国深度科技)

(编辑/菲拉格慕)